酶联免疫斑点检测（ELISPOT）操作步骤

    酶联免疫斑点检测是一种高灵敏度的免疫分析方法，特别适合用于检测细胞分泌的细胞因子，在免疫学研究中发挥十分重要的作用。其主要原理类似于酶联免疫吸附检测，是将一种针对待测抗原的抗体（捕获抗体）包被到覆盖PVDF膜的96孔板中，将细胞接种到96孔板中培养，细胞分泌的细胞因子与细胞周围的包被抗体特异性结合，细胞洗脱后，再利用标记生物素的针对待测细胞因子其它表位的检测抗体结合到待测细胞因子上，然后离心酶标亲和素和沉淀型底物反应形成的斑点检测分泌细胞因子的细胞。实验步骤如下：

1. 细胞培养:取出包被了捕获抗体的96孔PVDF板，接种一定密度的细胞，在一定刺激条件下，37℃孵育24～72小时。

2. 清洗：利用蒸馏水洗去细胞。

3. 检测抗体孵育：PVDF板各孔加入100μl检测抗体，室温或37℃孵育1小时。

4. 清洗：倒去检测抗体，利用洗涤液（含0.1%吐温20的PBS）清洗PVDF板3次，300μl/孔，每次1分钟。

5. 酶标亲和素孵育：各孔加入100μl酶标亲和素，室温或37℃孵育0.5小时。

6. 清洗：倒去酶标亲和素溶液，利用洗涤液清洗酶标板3次，300μl/孔，每次1分钟。

7. 底物反应：各孔加入100μl酶反应底物，室温或37℃孵育30分钟。然后利用蒸馏水清洗3遍洗去底物溶液，待PVDF板自然干燥。

    8. 自动斑点计数仪检测酶联免疫斑点数量。