细胞内因子流式细胞检测（FC)操作步骤

    流式细胞检测是具有高灵敏度、多参数、单细胞模式、定量能力强等多重优势的细胞分析方法。其中细胞内因子流式细胞检测尤其以样品处理简单和适用面广在生物医学研究中发挥重要作用。 实验步骤如下：

1. 收集细胞:将经过各种处理的待测细胞（如果是分泌型蛋白检测需要高尔基体阻断剂）收集到离心管中，4℃、300g离心5分钟，弃去上清，收集细胞。

2. Fc受体封闭：利用200μl流式细胞染色液（含0.2%BSA的PBS）重悬细胞，加入50μl Fc受体封闭抗体（利用流式细胞染色液稀释），冰浴10分钟。

3. 细胞表面染色：加入50μl细胞表面染色相关流式抗体（利用流式细胞染色液稀释），冰浴30分钟。

4. 清洗：各管细胞加入1ml流式细胞染色液，4℃、300g离心5分钟，弃去上清。

5. 固定破膜：利用上述细胞离心后残余液体重悬细胞，然后加入250μl细胞固定液，冰浴20分钟固定细胞。弃去多聚甲醛后，用冰冷PBS洗三遍，每次5分钟破膜：加入0.25%Triton X-100（PBS配制）破膜20分钟。

6. 清洗：4℃、600g离心5分钟，弃去细胞固定液；然后加入1ml破膜液，4℃、600g离心5分钟，弃去破膜液；再加入1ml破膜液，4℃、600g离心5分钟，弃去破膜液。

7. 细胞内因子染色：利用200μl破膜液重悬细胞，然后加入50μl细胞内因子染色相关流式抗体（利用破膜液稀释），冰浴30分钟。

8. 清洗：加入1ml破膜液，4℃、600g离心5分钟，弃去破膜液；再加入1ml破膜液，4℃、600g离心5分钟，弃去破膜液；加入400μl流式细胞染色 液重悬细胞

    9.上机检测。