免疫印迹检测（WB）操作步骤

免疫印迹检测的主要原理是在蛋白电泳分离蛋白的基础上，利用抗原抗体之间的特异性结合来检测目的蛋白，是一种定性能力强并具有半定量检测能力的免疫分析方法。实验步骤如下：

1. 样品制备: 利用RIPA裂解液裂解细胞或组织样品，4℃、10000g离心10分钟，取上清液进行蛋白定量，然后将所有样品校正到同一蛋白浓度，加入5×上样缓冲液,95℃金属浴加热10分钟，冰浴冷却样品。

2. 电泳：配制聚丙烯酰胺凝胶（根据目的蛋白分子量配制不同浓度凝胶），将样品加入凝胶上样凹槽，90V电压和300mA电流条件下电泳至样品中溴酚蓝跑出凝胶。

3. 电转：取PVDF膜，甲醇浸泡10分钟，然后将膜置于电转夹正极（下面垫上海绵垫和滤纸），电泳后的聚丙烯凝胶置于PVDF膜上，排除气泡，再铺上滤纸和海绵垫，再将电转夹置于电转槽中，120V电压和300mA电流条件下电转2小时（根据目的蛋白分子量可以适当调整电转时间）。

4. 封闭：电转结束后，取出PVDF膜，利用TBS缓冲液润洗后，放入5%脱脂牛奶中（TBS配制）室温震荡封闭1小时。

5. 一抗孵育：将PVDF膜的目的蛋白区域剪切下来，放到包被封口膜的玻璃板上，在膜上滴加0.5～1.5ml封闭液配制的一抗溶液室温孵育3小时或4℃过夜。

6. 清洗：将PVDF膜放入TBST（含0.1%吐温20的TBS）震荡清洗3次，每次5分钟。

7. 二抗孵育：将PVDF膜再次放到包被封口膜的玻璃板上，在膜上滴加0.5～1.5ml TBST配制的二抗溶液室温孵育2小时。

8.清洗：将PVDF膜放入TBST（含0.1%吐温20的TBS）震荡清洗3次，每次5分钟。

    9.上机检测。